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臺式低速離心機分離葉肉細胞的方法

2015/8/28 10:25:06??????點擊:

一、離心機分離法

分離葉肉細胞 [儀器與用具] 組織搗碎機一臺(或研缽一套); 低速臺式離心機1臺; 100目尼龍紗布30cm×30cm 1塊; 100ml量筒1個; 100ml燒杯2個; 200ml燒杯1個; 冰瓶1個; 離心管、吸管若干。

[試 劑] STN液(蔗糖0.4mol·L-1,Tricine 20mmol·L-1 pH 7.8, NaCl 10mmol·L-1)。將137g 蔗糖、3.58g Tricine(三羥甲基甘氨酸)、0.58g NaCl溶于800ml左右水中,用NaOH溶液調至pH 7.8,加水至1000ml。STN液置0-4℃冰箱中備用。

[方 法]
 1.選用山芋、大豆等植物的嫩葉50g左右,洗凈,去葉脈,剪成2mm左右寬的葉條,放入搗碎機中,加入150ml左右的冷STN液,以10000轉/分,快速搗碎15秒,或將10g左右葉片剪碎,放入研缽中,加入50ml冷STN液,研磨1分鐘。

 2.先將勻漿用100目的單層尼龍紗布過濾,將濾液用臺式離心機低速(500轉/min)離心30秒。去上層液,用少量STN液懸浮沉淀,懸浮液即為葉肉細胞。如果第一次離心后,沉淀中細胞碎片較多,可再懸浮離心一次。提取過程最好在4℃左右溫度下進行。

 3. 細胞懸浮液放冰瓶中備用。

 二、酶解法

分離葉肉細胞 [儀器與用具] 抽真空裝置1套或大針筒1套; 恒溫水浴(最好用恒溫振蕩器)1臺; 感量0.01g天平1臺; 離心機1臺; 100和50ml燒杯各2個; 鑷子1把; 剪刀1把; 100目尼龍紗布30cm×30cm 1塊; 刀片一把; 載玻片一塊。

 [試 劑] 分離介質:糖醇0.4mol·L-1 (稱7.3g山梨醇或甘露醇定溶于100ml水中),,離析酶(Macerozyme R-10)3%,葡聚糖硫酸鉀0.4%與聚乙烯吡咯烷酮2%,pH5.6~5.8,稱0.3g離析酶、0.04g葡聚糖硫酸鉀、0.2g聚乙烯吡咯烷酮溶于10ml 0.4mol·L-1山梨甘露醇溶液中,滴加HCl調至pH 5.6~5.8。 懸浮介質:STN液(配法同上)。

 [方 法]
 1. 取蠶豆等嫩葉2g左右,用鑷子撕去下表皮。不能撕表皮的可用剪刀剪,或用刀片切成2mm寬碎條。放燒杯中,加20ml分離介質,用抽真空裝置或針筒真空滲入15秒,使分離介質滲入葉內。

 2. 將酶解體系放入25~30℃水浴中,每隔2-3分鐘振動一次,酶解30分鐘左右,直至肉眼可見溶液中有較多的葉肉細胞沉淀為止。

 3. 用100目尼龍紗布過濾酶解介質,將濾液500轉/min離心30秒,舍去上層液,用10ml STN液懸浮沉淀,再離心一次,去上層液,沉淀中加入2mlSTN液稀釋,即得到葉肉細胞懸浮液,細胞懸浮液置冰瓶中備用。

 三、細胞活力的檢查

 [儀器與用具] 顯微鏡1臺;氧電極測定光合放氧裝置(見實驗23)1套;吸管3支;5mL、1mL移液管各2支;0.1mL微量進樣器;載玻片與蓋玻片若干等。

 [試 劑] 0.1%酚藏紅花染液; 光合放氧測定介質(Tricine 50mmol L-1 pH7.6,NaHCO3 20mmol L-1,蔗糖0.4mol L-1) 稱0.9gTricine、10.3g蔗糖、0.17gNaHCO3溶于80mL水中,用稀NaOH調至pH7.6,加水至100mL。

 [方 法]
 1、 檢細胞形態: 葉片中葉肉細胞的大部分是柵欄細胞和海綿細胞,多數呈花生形。活的葉肉細胞中的葉綠體排列規則,分布均勻,在高倍鏡下能看到細胞器在原生質體中移動。而受傷和死細胞,細胞收縮,葉綠體排列混亂,甚至解體,細胞內顆粒作無規則的布朗運動。

 2、 色檢查: 將0.1%酚藏紅花染液同細胞懸浮液混合,幾分鐘后鏡檢。死細胞被染上紅色,而活細胞不被染色。

 3、合放氧活性測定: 在氧電極反應杯中加5份光合放氧測定介質,1份細胞懸浮液,照光,觀察是否有放氧反應。

 注意事項

 1. 不是所有植物的葉片都能用機械法分離出完整的葉肉細胞的,機械法僅適用于山芋、大豆、花生、蘋果、槐樹等植物葉片。分離細胞的活性還與葉齡有關,如分離具有高活性的大豆葉肉細胞,應采集倒2、倒3的嫩葉作為材料。

 2. 離體的葉肉細胞的活性隨離體時間延長而降低。

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